БИОХИМИЯ - Основные питательные вещества человека - 2016 год

1. БЕЛКИ

1.8. Практическая часть. Определение аминокислот и белков

Цель работы - изучить строение и основные свойства аминокислот и белков.

Присутствие белка в биологических объектах и пищевых продуктах можно обнаружить с помощью качественных (цветных) реакций на структурные компоненты белка и его функциональные группы. Все известные реакции выявления белков и пептидов можно разделить на три типа:

1) реакция на пептидную группу, специфичная для белков и пептидов (биуретовая реакция);

2) реакции на концевые α - NH2- или α – СООН - группы, которые дают также свободные α - аминокислоты и некоторые другие соединения;

3) реакции на отдельные боковые радикалы или группы аминокислот, входящих в полипептиды. Эти реакции специфичны и для свободных а-аминокислот.

Опыт 1. Биуретовая реакция на пептидную группу (реакция Пиотровского)

В щелочной среде в присутствии солей меди (II) растворы белка приобретают фиолетовый цвет с красным или синим оттенком, зависящим от количества пептидных связей в молекуле белка. Такую реакцию дают все белки, а также продукты их гидролиза, содержащие не менее двух пептидных связей.

В щелочной среде пептидная группа переходит в таутомерную енольную форму:

В избытке щелочи ОН - группа диссоциирует, на атоме кислорода появляется отрицательный заряд, с помощью которого он взаимодействует с ионом Сu2+.

Кроме того, у меди появляются дополнительные координационные связи с атомами азота пептидных связей. При этом образуется стабильный окрашенный биуретовый комплекс.

Биуретовую реакцию дают также некоторые небелковые вещества, например, биурет (NH2-СО-NН-СО-NН2), оксамид (NН2-СО-СО-NН2). ряд свободных аминокислот (гистидин, серин, треонин, аспарагин) при больших концентрациях их в растворе.

В пробирку вносят 0,5 мл 10 % исследуемого раствора, такое же количество 10 % раствора гидроксида натрия (NaOH) и 6 -10 капель 5 % раствора сульфата меди (СuSO4), смесь слегка встряхивают. Наблюдают за появлением окрашивания. Голубая окраска раствора, свойственная солям меди (II), по мере образования комплексного соединения переходит в другую (в отчете указать окраску полученного раствора).

1. Провести данную реакцию с 10 % раствором яичного белка. Отметить в отчете, окрасилась ли смесь.

2. Провести данную реакцию также с 10 % раствором аминокислоты, указанной преподавателем. Будет ли наблюдаться характерное окрашивание раствора?

3. В отчете сделать вывод о наличии в аминокислотах и белках пептидных связей.

Опыт 2. Нингидриновая реакция на α - NH2 - группу

Метод основан на взаимодействии нингидрина с α - NH2 - группой аминокислот, пептидов и белков с образованием окрашенного комплекса синего или сине-фиолетового цвета.

При нагревании аминокислот с водным раствором нингидрина происходит окислительное дезаминирование аминогруппы аминокислот и пептидов. Восстановленный нингидрин конденсируется с NH3и другой молекулой окисленного нингидрина, образуя сине-фиолетовый комплекс Руэмана.

В пробирку вносят 5 капель исследуемого раствора, добавляют 5 капель 0,5 % раствора нингидрина, нагревают до кипения и выдерживают несколько минут. Наблюдают за появлением окрашивания раствора.

1. Провести данную реакцию с 10 % раствором аминокислоты. Отметить цвет и интенсивность окраски раствора аминокислоты.

2. Провести данную реакцию с 10 % раствором яичного белка. Наблюдается ли окрашивание смеси?

3. Сделать вывод о наличии в аминокислотах и белках α - NH2 - группы.

Опыт 3. Ксантопротеиновая реакция на ароматическое кольцо аминокислот

При добавлении к раствору аминокислот концентрированной азотной кислоты и нагревании появляется желтое окрашивание, в присутствии щелочи переходящее в оранжевое.

Реакция характерна для ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина, триптофана), образующих динитропроизводные желтого цвета. В щелочной среде последние превращаются в оранжевые соли хиноидной структуры:

Ксантопротеиновую реакцию дают почти все белки. Исключение составляет, например, желатина, в молекуле которой практически полностью отсутствуют ароматические аминокислоты.

В пробирку вносят 5 капель исследуемого раствора, добавляют три капли концентрированной азотной кислоты (HNO3) и нагревают до кипения (осторожно!), наблюдая за появлением окрашивания содержимого пробирки. Пробирку охлаждают под струей холодной водопроводной воды и по каплям осторожно добавляют в нее 10 % раствор гидроксида натрия (NaOH) до начала изменения окраски смеси (около 10 капель). Сделать вывод о наличии в исследуемых растворах ароматических аминокислот.

1. Провести реакцию с 10 % раствором ароматической аминокислоты (тирозином или фенилаланином). Отметить в отчете, окрасился ли раствор.

2. Провести реакцию с 10 % раствором яичного белка. Отметить в отчете, окрасилась ли смесь.

3. Сделать вывод о наличии в составе молекул яичного белка ароматических аминокислот.

Опыт 4. Реакция Адамкевича (на триптофан)

Этот метод основан на способности триптофана вступать в реакцию конденсации с веществами, имеющими альдегидную группу, с образованием окрашенных продуктов. Так, при добавлении к раствору триптофана незначительных количеств глиоксиловой кислоты в присутствии концентрированной серной кислоты раствор приобретает красно-фиолетовый цвет.

Для проведения реакции используют ледяную уксусную кислоту, в которой как примесь всегда присутствует глиоксиловая кислота. Серная кислота играет роль водоотнимающего средства.

В пробирку вносят 5 капель 10 % исследуемого раствора аминокислоты, добавляют 10 капель ледяной уксусной кислоты (СН3СООН) и осторожно нагревают до растворения выпавшего осадка. Затем содержимое пробирки охлаждают и осторожно, наклонив пробирку, по стенке (чтобы жидкости не смешивались) приливают 10 капель (0,5 - 1,0 мл) концентрированной серной кислоты (H2SO4). При вертикальном положении пробирки на границе двух слоев жидкости возникает характерное красно-фиолетовое окрашивание в виде кольца, которое постепенно распространяется на весь раствор. Появление окраски можно ускорить, поместив пробирку в кипящую водяную баню.

1. Провести реакцию с 10 % раствором триптофана. Отметить в отчете, окрасилась ли смесь.

2. Провести реакцию с 10 % раствором яичного белка. Отметить в отчете, окрасилось ли содержимое пробирки.

3. Сделать вывод о наличии в молекуле яичного белка аминокислоты триптофан.

Опыт 5. Реакция Фоля

Это качественная реакция на серосодержащие аминокислоты. Так, при добавлении к раствору такой аминокислоты гидроксида натрия (NaОН). уксуснокислого свинца (II) - (СН3СОО)2Рb и последующем кипячении смесь темнеет. Эти аминокислоты подвергаются щелочному гидролизу с образованием сульфида натрия (Nа2S):

Ацетат свинца (II) реагирует с раствором щелочи с образованием плюмбита натрия:

Сульфид натрия (Na2S) с плюмбитом натрия (Na2PbO2) дают черный или бурый осадок сульфида свинца (II):

В реакцию Фоля не вступает желатина, так как в состав молекулы этого белка не входят серосодержащие аминокислоты. Желатина (коммерческое название - желатин) - ценный белок, получаемый из хрящей и сухожилий крупного рогатого скота и используемый для изготовления пищевых продуктов (желе, студня).

В пробирку вносят 1 мл 10 % исследуемого раствора, затем добавляют 1 мл реактива Фоля и кипятят 2-3 минуты. Наблюдают за изменением цвета и образованием осадка.

Для приготовления реактива Фоля смешивают равные объемы 5 % раствора ацетата свинца (II) - (СН3СОО)2Рb и 30 % раствора гидроксида натрия (NаОН) до растворения образующегося осадка.

1. Провести реакцию с 10 % раствором серосодержащей аминокислоты (цистеином). Отметить в отчете, окрасился ли раствор.

2. Провести реакцию с 10 % раствором яичного белка. Отметить в отчете, окрасилась ли смесь.

3. Сделать вывод о наличии в молекуле яичного белка аминокислот, содержащих серу.